实战｜用LIC三天构建一个质粒——第一天

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大规模的基因表达是研究蛋白质结构和功能的基础。基因表达需要构建相应的表达载体——DNA片段或者质粒。LIC（音“立刻”）技术，全称为ligation–independent cloning （不依赖于连接反应克隆），已经在表达载体的构建方面得到了广泛应用。LIC技术提高了表达载体构建过程中的连接效率，降低了克隆产物假阳性率，是一个对初学者极其友好的分子克隆手段。其过程如下：准备好插入片段（insert，含有目的蛋白基因序列）和LIC载体（template，含有抗性蛋白，启动子，标签蛋白和标签蛋白切除位点）后，使用T4酶产生相对较长的黏性末端，直接转化入宿主细胞（E.coli）, 让E.coli自己完成连接（Ligation）过程。LIC不依赖于基因序列，不需要体外连接反应，是简化的、高效的分子克隆技术。本文将与大家分享如何在材料齐全的情况下，在三天内利用LIC高效地构建一个质粒的第一天。

01 设计质粒

所谓的设计质粒，其实就是将template和insert直接连接在一起的过程。设计后的质粒的线性排列如下：抗性蛋白—启动子上游—标签蛋白—切割位点—insert—启动子下游—Lac 操纵子。一般情况下，需要根据所在室验室的偏好来选择template，确定其基因序列。准备做基因表达的实验室，一般都含有一些能够表达蛋白的质粒（如果是新实验室，可以直接从Addgene上购买含有目的template的E.coli）。抗性蛋白为E.coli提供抗性（抗生素，如Amp或者 Kan，），从而只有含有载体的E.coli可以生长，表达目的蛋白。启动子是RNA聚合酶结合的位置（不是翻译的起始点）。标签蛋白可以是His6, His6-Sumo, his6-MBP, GST，或者GFP。标签蛋白是翻译的起始位点。在分离纯化的后期，尤其是研究蛋白结构的时候，表达的标签蛋白常常需要被切割掉，因此标签蛋白和目的蛋白之间通常需要插入蛋白酶切割位点，如 Tev, Thrombin或者ULP1等。蛋白酶切割位点后通常不插入任何碱基，直接插入完整的目的蛋白的基因序列（反复确认，保证阅读框与前面的蛋白酶切割位点重合）。切记，在完整的目的蛋白的基因序列之后，加入终止密码（TAA 或者TAG）。终止密码后的启动子下游—Lac 操纵子直接粘贴原始的载体序列即可。例如：

1）. Kan-T7pro-his6-MBP-Tev-Insert-TAA-T7term-Lac

2）. Amp- T7pro-GST-Thrombin-Insert-TAA- T7term -Lac

假设我们采用Addgene的 pMJ806为template（提供Kan-T7pro-his6-MBP-Tev……T7term-Lac）,需要将人 的全长HP1a 插入进该template。从而，表达his6-MBP-（Tev）-HP1a多肽链（进行Tev切割后，剩下全长HP1a）。

图一. Addgene pMJ806 (由Jennifer Doudna提供)的环形图，以及人源全长HP1a.

 

进行拼接后，我们获得了表达人源全长HP1a的目的质粒（纸面上的）。其环形图如下：

图二. 构建的目的质粒环形图，包含有Kan-T7pro-his6-MBP-Tev-humanHP1a-T7term-Lac，全长为6964bp (insert, 576bp; template 6388 bp)。

 

02 设计引物

LIC需要 2个线性DNA片段（一个是template，一个是insert）来进行反应，形成最终的环形质粒。这两个DNA片段都是有PCR反应完成的。要进行这2个PCR反应，就必须设计2对引物。这两对引物都可以（必须）根据已经设计好的目的质粒来设计。Template的引物设计相对简单，只需20 bp左右。Insert的引物设计相对复杂，它必须包含一部分template（10-15 bp）和一部分insert（~20 bp）。引物的结尾处最好以G核苷酸为最佳。具体如下图。

图三. LIC的引物设计。

 

从上图可以看出，LIC的引物设计是非常严苛的，呆板的。载体的引物位点是严格控制的，一半以终止密码为起始，包含～20个碱基对；另一半在蛋白酶切割位点处。Insert的上下游引物都必须包含一部分template，一部分insert的碱基序列，因此相对较长，～35bp。在50 bp内，IDT的DNA合成准确率是可以保证的，因此不必担心含有突变。

 

03 订购引物，准备PCR的模板

设计了引物之后，确认没有错误，那就可以立刻订购引物了。IDT的引物非常快，一般第二天就可以。同时，两个PCR反应需要与之对应的DNA模板——培养相应的DH5a，过夜，分别提取质粒。

 

04 为第二天的PCR和LIC反应做准备

准备高保真PCR反应所需的PCR mix，提前预定第二天上午的PCR仪（2个）；准备Bpn1（一种甲基化DNA切割酶）；准备DNA琼脂糖凝胶提取试剂盒。准备T4酶（具有3’->5’DNA 切割能力）。准备感受态E.coli（DH5a 和BL21）；准备LB培养基，琼脂糖-LB培养基（Kan）。

 

小结

用LIC，三天构建一个质粒，不是梦。第一天的任务相对简单：1）设计质粒（复制，粘贴），约20分钟；核查3分钟；2）设计引物，20分钟；核查3分钟；订购引物（交给lab manager）1 分钟；3) 培养含有PCR反应模板的E.coli, 30 min; 4) 准备第二天的试剂。除了LB培养基和琼脂糖-LB培养基需要自己准备，其他的都是实验室长备的东西。因此，第一天的任务相对轻松，满打满算3个小时的活。如果小伙伴们有任何疑问，欢迎留言。明天，我们继续LIC。

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