过夜生长在琼脂糖- LB平板上的菌落，过目可知。也许你会很惊讶，为什么LIC后的平板上只有可怜的几个菌落？是的，这是正常的。根据我们的经验，这些单一菌落是目的质粒的可能性非常大。相反，如果你的琼脂糖- LB平板上到处是菌落，那这些菌落是假阳性的概率很高。能够生长在这些含有抗生素的平板上的菌落必定含有抗性基因，因此，这些假阳性菌落多半是含有template的质粒。进一步分析，应该是Bpn1消化过程中出现了差错。菌落PCR是检验这些菌落是否含有insert的直接方法。菌落PCR的DNA模板就是这些菌落——将移液器的枪头在标记好的菌落上点一下（挑取），然后吹打进PCR反应体系中即可。标记菌落的目的是为了在下次寻找相应的阳性菌落的时候，简单快捷。菌落PCR的引物就是insert PCR的引物，无需额外定制引物。菌落PCR的反应条件（退火温度，延伸时间）与insert PCR的一致。细心的小伙伴甚至会用提供template的质粒作为隐性对照，以提供insert的质粒作为阳性对照。总结的时候，将template PCR, insert PCR 和菌落PCR并排放在一起的时候，完成的LIC实验过程就出来了，如图一。
图一. Template PCR, insert PCR 和菌落PCR的电泳结果。选取的两个菌落都是阳性。
当平板上有大量菌落时，应该多挑取一些菌落作PCR。如下图，我们挑取了7个菌落做PCR，但是，只有#4 菌落含有insert。(这里能检测出#4，含有运气成分。)
图二. Template PCR, insert PCR和菌落PCR的电泳结果。选取的7个菌落，只有一个是阳性。
LIC的反应体系是10 ul，而一个转化反应通常只需要5 ul。因此，为了避免浪费，5 ul可以转化到DH5a 中，专门用来提取目的质粒；另外5 ul转化到BL21 （升级版本的叫作Rosetta）中，专门用来做目的蛋白的表达和纯化。
