用LIC三天构建一个质粒——第二天

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今天是利用LIC构建质粒的极其重要的一天。我们需要进行2个高保真PCR反应，进行胶回收，从而获得线性的template和insert；需要进行LIC反应；需要将LIC反应产物分别转化到DH5a（用于质粒提取）和BL21（用于蛋白表达）中，并接种到琼脂糖- LB平板中。 

1. PCR反应

早上来到实验室后，立即从lab manager那里收取template和insert的引物，分别用超纯水配置成10 uM的溶液（50 ul就好），冰浴。从过夜培养的E.coli中，分别提取2个PCR 反应所需的模板，确定浓度，冰浴。将高保证聚合酶PCR mix (以Q5 为例)和超纯水从冰箱中取出，冰浴。按下面体系分别进行PCR反应 (25 ul)，每个PCR做一个重复：

图一. PCR反应体系已经PCR条件设置。

（https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491）

 

PCR反应是分子克隆的基础，也是决定LIC成功与否的关键一步。要想获得单一的条带，必须设置：1）良好的退火温度；2）相对准确的延伸时间。退火温度是根据引物Fwd和Rev的Tm值（IDT为每个引物都提供Tm值）来确定的。在实践中，一般采用相对较低的Tm + 3oC为准。例如，Fwd和Rev的Tm分别为59.1oC和65.2oC，那退火温度就设置为62.1oC。当Tm + 3oC > 72oC时，进行“2-step”PCR，即退火温度和延伸温度都是72 oC。延伸时间是根据template或者insert长度来设置的。上文构建的Kan-T7pro-his6-MBP-Tev-humanHP1a-T7term-Lac质粒，template （6388 bp,） insert （576 bp），其PCR延伸时间应该分别设置为195s 和30s。当你的PCR获得了单一的条带时（如图三），你已经成功了一半。

图二. PCR反应获得单一条带。

2. Bpn1消化PCR反应的模板DNA并胶回收

当发现PCR产物是单一条带时，立即将PCR产物进行Bpn1消化（50 ul, 37oC， 1小时）。（这是去吃中饭的最佳时间！！！）Bpn1特异性的消化甲基化的DNA，即PCR反应中加入的DNA模板。template PCR过程中加入的DNA模板(甲基化的plasmid)，在PCR完成后是必须经过Bpn1消化——这个甲基化的plasmid含有与目的质粒相同抗性基因。不去掉这个甲基化的plasmid，LIC后长在平板上的菌落会很多；但是，它们多半是假阳性的。同理，如果insert PCR的DNA模板也含有与目的质粒相同抗性基因，那么其PCR反应也需要Bpn1消化。当电泳结果显示为单一条带（如图二），在Bpn1消化后，你可以跳过电泳和胶回收，直接利用PCR DNA 提取试剂盒，提取PCR产物。这种方法获得PCR产物比较高效。当电泳结果显示为2-3条条带时，只好根据DNA marker的大小来切取目的片段。此时，获得PCR产物的浓度有可能偏低。 

3. LIC反应

胶回收后，LIC 的反应体系（10 ul）就可以建立了，如下：
template, 50-100 ng;insert, 100-200 ng;

0.25 ul T4 DNA pol。

LIC 的反应体系（10 ul）建立后，先常温下静置10分钟，再冰浴20分钟（阻止过度反应）。将LIC 的反应混合物，5 ul 加入到DH5 感受态（50 ul）中，5 ul加入到BL21 感受态(50 ul) 中，冰浴15分钟，让反应产物与感受态充分接触。 

4. 转化与涂平板

将感受态细胞分别热激，42oC，30s; 然后，冰浴5 分钟。在含有感受态的EP管中，加入500 ul的LB培养液（不要加入任何的抗生素）, 然后置于培养箱中37oC， 220 rpm, 40分钟。最后，涂平板。 

小结

今天是格外繁忙的一天。2个PCR反应3小时，跑胶看条带30分钟。吃饭之前，Bpn1消化1小时。胶回收1小时，LIC反应40分钟，转化20分钟。培养，40分钟。涂平板，10分钟。几乎8个小时。早九晚五就好，回家睡觉。明天，我们看平板，检验自己的动手能力。

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